AG百家乐细胞培养指南：在细胞培养过程中，良好的培养条件至关重要。培养条件应为气相：95%空气和5%二氧化碳，温度保持在37℃。传代方法建议采用1:2的比例进行，传代情况需在2天后更换培养液。

在细胞培养的初期，建议同时购买配套的培养基，以获得更大的优惠。接收细胞后，待其处理至良好状态后，灌满完全培养液并认真封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。

收到细胞后，首先用75%酒精喷洒整个细胞瓶以进行消毒，然后将其放在超净工作台内，确保操作过程严格无菌。将细胞瓶放入37℃和5% CO2的培养箱中，静置3-4小时以稳定细胞状态，之后再进行下一步处理。

在显微镜下观察细胞的生长情况并进行拍照保存（建议拍摄40x、100x、200x的各一张）。前三天的照片将作为售后服务的重要依据，若不提供照片则默认收到的状态良好。

细胞培养步骤

一、细胞传代：如果细胞汇合度未超过80%，应将瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml的培养基在37℃、5% CO2孵箱中培养；若细胞密度超过80%，可直接进行传代培养，步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放入37℃培养箱中消化1-2分钟。显微镜观察细胞，若大部分细胞变圆并脱落，迅速将其取回操作台，并轻轻敲打培养瓶，添加5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落后吸出，再将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

二、悬浮细胞传代步骤：

1. 采用半换液法，竖着放置培养瓶于培养箱静置1小时，随后轻轻吸出约3ml的培养基并补充3ml完全培养基。若培养基慢变色，可直接添加约500μl的FBS。在传代时可直接增加5ml的培养基，分为两个培养瓶，通常传代3次后可进行一次离心处理以去除死细胞。
2. 采用离心换液法，需分瓶时，请将细胞悬液收集到离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清，再补加1-2ml培养液重悬后，按1:2的比例分到新的T25瓶中，添加6-8ml按照说明书配置的新培养基以保持细胞活性。后续传代根据实际情况按比例1:2至1:5进行。

细胞冻存：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗一次。
2. 向培养瓶内添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，留意细胞变化，待其回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化。轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml的AG百家乐无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞立即放入-80℃冰箱。如需要转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中保存24小时以上后再转入。

细胞复苏：

1. 从液氮中取出冻存管（记得佩戴防护设备），快速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，使用5ml完全培养基重悬细胞，并将其接种至T25培养瓶，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天，使用新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项：某些细胞对培养基的附着力较弱，运输过程中可能会发生细胞脱落，这是正常现象。如脱落较多，请将所有培养液收集至离心管中，1000 RPM离心5分钟，收集清液进行过渡培养。沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打以重悬，消化1-2分钟后，再加入5ml完全培养基终止反应。重新离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。之后，按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养。