在现代生命科学领域，蛋白质的一级结构，也就是氨基酸序列，已不再被看作是静态的分子代码。它不仅决定了蛋白质的空间构象和功能特性，更深入地影响着细胞行为、信号通路的动态变化，甚至是进化路径与疾病机制。因此，精确获取蛋白质序列成为理解其生物学功能与作用机制的关键起点。

与传统的“蛋白鉴定”方法不同，蛋白测序（Protein Sequencing）关注的是完整且连续的氨基酸信息，目的在于解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白的一致性，以及追踪翻译后修饰等关键科研任务。在生物药物开发、个体化医学、结构生物学与抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精细化能力正在成为重要的决策技术杠杆。

一、蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学研究中，“测序”和“鉴定”等术语常常交替使用，这导致了术语的误用、技术选择失误，甚至混淆研究假设。从定义来看，蛋白测序是对蛋白质氨基酸序列进行解析的过程，旨在重建其一级结构的连续排列，通常以N端到C端的方向表示全部或部分氨基酸序列。其目标在于获取“序列本体”，而不仅仅是判断蛋白的“存在性”或“类别归属”。而蛋白鉴定（Protein Identification）则依赖质谱与数据库匹配，确定某一肽段是否“属于”已知蛋白，本质是分类式的归属判断，而非逐位点的信息重建。

二、蛋白测序技术的演变

1. Edman降解：高精度线性识别的开端

Edman降解是由Pehr Edman于20世纪50年代建立的，是首次实现蛋白质序列解析的化学方法。该方法基于苯异硫氰酸（PITC）与N端氨基酸的特异性反应，通过顺序标记与切除，在每一轮循环中释放并鉴定一个PTH-氨基酸，实现线性序列重建。虽然该方法在合成肽质量验证和生物制品结构一致性评估中仍具有优势，但它的适用性受到游离N端纯化样品和序列长度的限制。

2. Bottom-up质谱策略：高通量测序的核心

质谱技术的引入标志着蛋白测序发展的重要转折点。Bottom-up策略通过特异性蛋白酶（如胰蛋白酶）将蛋白质酶解为短肽段，并利用LC-MS/MS进行碎裂与检测，随后通过数据库比对或de novo算法重建蛋白质序列。这种方法具有良好的通量和覆盖度，但也存在着序列上下文信息缺失和识别歧义的问题。

3. Top-down质谱策略：整分子结构识别的深入拓展

与Bottom-up方法不同，Top-down测序策略直接将完整的蛋白质送入高分辨率质谱系统，通过高能碎裂技术解析其多级碎片离子，提供精确的序列与修饰定位信息，特别适用于需识别翻译后修饰（PTM）的研究。然而，该方法对样本纯度、稳定性及质谱平台的要求较高。

4. 单分子蛋白测序的崛起

传统质谱测序策略通常依赖于肽段碎裂与谱图反演重建。近年来，研究者开始尝试发展单分子测序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）技术，旨在无需酶解、直接读取氨基酸顺序。此类技术如纳米孔测序和荧光法测序，允许在不损害蛋白整体结构的情况下，实现单个分子的逐残基识别。

蛋白测序技术缺乏模板依赖，存在天然异质性，并常伴随多重翻译后修饰，其测序结果往往是实验策略、物理分辨率与数据模型之间的动态平衡的结果。不同的测序技术路径，从化学降解到质谱分析，再到单分子层面的直接读取，形成了一套相辅相成的信息获取体系。这些技术并非相互替代，而是在面对不同研究目标与样本约束下，实现结构精确性、序列覆盖率与修饰还原度之间的平衡。

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